蛋白電泳 SDS-PAGE及Western blot

更新時(shí)間：2018-04-13

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蛋白電泳 SDS-PAGE原理

SDS是一種陰離子表面活性劑，能打斷蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵，并按一定的比例和蛋白質(zhì)分子結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其本身原有的電荷，掩蓋了各種蛋白分子間天然的電荷差異。因此，各種蛋白質(zhì)-SDS 復(fù)合物在電泳時(shí)的遷移率，不再受原有電荷和分子形狀的影響，而只是棒長(zhǎng)的函數(shù)。這種電泳方法稱(chēng)為SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（簡(jiǎn)稱(chēng)SDS—PAGE）。實(shí)驗(yàn)使用過(guò)程中，還加入DTT或者巰基乙醇，以打開(kāi)蛋白間的二硫鍵，破壞蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)。SDS—PAGE常采用垂直板不連續(xù)系統(tǒng)（分離膠與濃縮膠）。

一、樣品制備

本公司有多種用于樣品制備的組織裂解液，每款裂解液會(huì)配備一管蛋白酶抑制劑pmsf。本公司還有多種蛋白酶抑制劑供您使用。

實(shí)驗(yàn)試劑
蛋白提取
蛋白定量

產(chǎn)品貨號(hào)	產(chǎn)品名稱(chēng)
R0010	RIPA_
R0020	普通RIPA
R0030	非變性組織細(xì)胞裂解液
A8260	Aprotinin 蛋白酶抑制劑（抑肽酶）
P8100	Pepstatin A 胃蛋白酶抑制劑
P1260	(All-in-one,100x)蛋白磷酸酶抑制劑混合物
T8031	Trypsin inhibitor 胰蛋白酶抑制劑
P1260	(All-in-one,100x)蛋白磷酸酶抑制劑混合物
539133	Protease Inhibitor Cocktail Set VI
539134	Protease Inhibitor Cocktail Set III
PC0030	Lowry法蛋白濃度測(cè)定試劑盒
PC0010	Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒>
PC0020	BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒

注：本系列蛋白提取試劑所提取的蛋白由于含有去污劑，所以不適合于Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒，請(qǐng)選擇BCA法或者Lowry法。

產(chǎn)品貨號(hào)	產(chǎn)品名稱(chēng)	說(shuō)明
R0010	RIPA組織/細(xì)胞裂解液	在普通RIPA的基礎(chǔ)上改進(jìn)而來(lái),含蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑(配有一支PMSF)
R0020	RIPA組織/細(xì)胞裂解液	RIPA經(jīng)典配方，適于絕大多數(shù)蛋白-蛋白相互作用的免疫實(shí)驗(yàn)。組成： 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS.(配有一支PMSF) 保存： 4 ºC避光
R0030	非變性組織/細(xì)胞裂解液	非變性條件下裂解的蛋白產(chǎn)物大限度地保留了蛋白的特性和功能，如抗原-抗體結(jié)合或酶學(xué)活性，因此適宜于進(jìn)行免疫共沉淀。
R0050	核蛋白提取試劑盒
BC3640	全蛋白提取試劑盒
BC3720	植物蛋白提取試劑盒
BC3710	全蛋白提取試劑盒（強(qiáng)）
BC3711	全蛋白提取試劑盒（中）
BC3730	磷酸化蛋白提取試劑盒
BC3740	胞漿蛋白提取試劑盒

蛋白含量測(cè)定是以標(biāo)準(zhǔn)蛋白作為對(duì)照，根據(jù)蛋白濃度不同，吸光值不同而達(dá)到定量的目的。有些方法是理解蛋白本身的吸光值（紫外光譜吸收法）來(lái)定量，但更多的是用染料對(duì)蛋白進(jìn)行染色，利用染料與蛋白結(jié)合顯出與原染料及蛋白不同的吸光值來(lái)定量的。后一種方法應(yīng)用更普遍。蛋白定量方法的選擇，應(yīng)該考慮到蛋白結(jié)構(gòu)（標(biāo)準(zhǔn)品選擇）、蛋白溶液內(nèi)干擾物等因素的影響。

產(chǎn)品貨號(hào)

產(chǎn)品名稱(chēng)

組成

說(shuō)明

PC0010

Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒

5×G250染色液	100ml	2-8℃
BSA(5 mg/ml)	1ml	-20ºC
PBS稀釋液	30ml	2-8℃

干擾物質(zhì)少， Tris、糖、甘油、巰基乙醇、氨、EDTA等均不干擾測(cè)定。

PC0020

BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒

BCA Reagent	100ml	2-8℃
Cu Reagent	3.0ml	2-8℃
BSA(5 mg/ml)	1ml	-20ºC
PBS稀釋液	30ml	2-8℃

BCA法的顯著優(yōu)點(diǎn)是不受去垢劑的影響。

PC0030

Lowry法蛋白濃度測(cè)定試劑盒

Folin酚甲試劑A	200ml	2-8℃
Folin酚甲試劑B	5ml	2-8℃
Folin酚乙試劑	20ml	2-8℃
BSA(5 mg/ml)	1ml	-20ºC
PBS稀釋液	30ml	2-8℃

Lowry法測(cè)定較為不受脂類(lèi)物質(zhì)干擾，適于脂類(lèi)含量較高的樣品測(cè)定。也能耐受相當(dāng)濃度的去垢劑如SDS。

二、蛋白電泳

實(shí)驗(yàn)試劑
預(yù)制膠
制膠
上樣及電泳
染色

SDS-PAGE如今已形成成熟的方案，實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)自己的情況和習(xí)慣來(lái)選擇試劑。如選擇1、2、3、4、5、6、7、8、9全部試劑可自己配制。也可以選擇配制好的試劑。如10、11、12、13/14、16、9、20。還可選擇10、13/14、16、9、17、18、19、20。

系號(hào)	產(chǎn)品貨號(hào)	產(chǎn)品名稱(chēng)	系號(hào)	產(chǎn)品貨號(hào)	產(chǎn)品名稱(chēng)
1	T8060	TRIS 三羥甲基氨基甲烷	11	S1051	4XSDS-PAGE分離膠緩沖液（PH=8.8）
2	G8200	Glycine 甘氨酸	12	S1052	4XSDS-PAGE濃縮膠緩沖液（PH=6.8）
3	S8010	SDS 十二烷基*	13	P1016	4×蛋白上樣緩沖液(含β-巰基乙醇)
4	A8080	Acrylamide 丙烯酰胺	14	P1015	4×蛋白上樣緩沖液(含DTT)
5	M8200	N,N-Methylene Bisacrylamide甲叉雙丙烯酰胺	15	D1070	1M DTT
6	A8090	Ammonium Persulfate 過(guò)硫酸胺	16	A1030	10%過(guò)硫酸氨
7	D8220	DTT 二硫蘇糖醇	17	T1020	1M Tris-HCL (PH6.8)
8	M8210	β-Mercaptoethanol β-巰基乙醇	18	T1010	1.5M Tris-HCL(PH8.8)
9	T8090	TEMED 四甲基乙二胺	19	S1010	10%SDS
10	A1010	30%丙烯酰胺（29:1）	20	T1070	5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液

凝膠配制表（一）

	分離膠12%	分離膠10%	分離膠8%	濃縮膠（3%）
總體積	10ml	10ml	10ml	5ml
4X分離膠緩沖液（PH8.8）	2.5ml	2.5ml	2.5ml	0
4X濃縮膠緩沖液（PH6.8）	0	0	0	1.25ml
30%丙烯酰胺(29:1)	4ml	3.3ml	2.7ml	0.5ml
ddH2O	3.4ml	4.1ml	4.7ml	3.2ml
10%過(guò)硫酸銨	100ul	100ul	100ul	75ul
TEMED	10ul	10ul	10ul	7.5ul

凝膠配制表（二）

	分離膠12%	分離膠10%	分離膠8%	濃縮膠（3%）
總體積	10ml	10ml	10ml	5ml
30%丙烯酰胺(29:1)	4ml	3.3ml	2.7ml	0.5ml
1M Tris-HCL (PH6.8)	0	0	0	0.625ml
1.5M Tris-HCL(PH8.8)	2.5ml	2.5ml	2.5ml	0
10%SDS	100ul	100ul	100ul	50ul
ddH2O	3.3ml	4.0ml	4.6ml	3.75ml
10%過(guò)硫酸銨	100ul	100ul	100ul	75ul
TEMED	10ul	10ul	10ul	7.5ul

本公司的丙烯酰胺是29：1的，如需要定制其他規(guī)格的可以。為了客戶(hù)實(shí)驗(yàn)方便，我們生產(chǎn)的SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（P1200）和Tris- Tricine-SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒（P1320），后者主要用于小于10kd的蛋白和多肽的分離。包含了制膠的全部試劑，方便客戶(hù)操作。如果您想節(jié)省時(shí)間，也可以使用我們的預(yù)制膠，無(wú)需配膠，直接跑電泳即可。本公司的上樣緩沖液既有用于非變性的（P1017、p1027）又有變性的（P1015、P1016、P1017、P1018），有不同的稀釋倍數(shù)，可以滿(mǎn)足客戶(hù)的多種實(shí)驗(yàn)需求。電泳緩沖液既有用于普通的tris-甘氨酸緩沖系統(tǒng)的產(chǎn)品（T1070），又有用于Bis-tris這種系統(tǒng)的MOPS緩沖液（T1510）蛋白marker有多種，非預(yù)染marker、預(yù)染marker、彩虹marker、Western Blot Marker。而且還有GE原裝的變性非變性marker，廣泛的分子量和用途供您選擇。

產(chǎn)品貨號(hào)	產(chǎn)品名稱(chēng)	產(chǎn)品貨號(hào)	產(chǎn)品名稱(chēng)
P1015	4×蛋白上樣緩沖液（含DTT）	P1016	4×蛋白上樣緩沖液（含β-巰基乙醇）
P1018	2×蛋白上樣緩沖液（含DTT）	P1019	2×蛋白上樣緩沖液（含β-巰基乙醇）
P1017	4×非變性蛋白上樣緩沖液	p1027	2×非變性蛋白上樣緩沖液
T1070	5×Tris甘氨酸電泳緩沖液	T1510	Tris-Mops緩沖液(10×)
PR1300-15	次高分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn) 15T	PR1400-20	低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(14.4-97.4KD) 20T
PR1500-10	次高分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn) 10T	PR1600-20	預(yù)染低分子量蛋白質(zhì)(14.4-97.4KD) 20T
PR1700-10	預(yù)染次高分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn) 10T	PR1800-10	Western Blot Marker 10T(50ul）
PR1900	預(yù)染超低分子量蛋白marker（3.3-31KD) 20T	PR1910	彩虹180廣譜蛋白marker 20T (100μ1)/50T(250μ1) /100T(500μ1)
PR1920	彩虹245廣譜蛋白marker 20T (100μ1)/50T(250μ1) /100T(500μ1)	PR1930	彩虹245plus廣譜蛋白marker 20T (100μ1)/50T(250μ1) /100T(500μ1)

跑膠后的染色可以用銀染或者考染的方法，如果蛋白量少，推薦使用靈敏度高一些的銀染試劑盒（G7210），否則常規(guī)染色可以使用（P1305）和（P1300），其中P1300的優(yōu)點(diǎn)是染色時(shí)間短，半小時(shí)內(nèi)即可檢測(cè)到蛋白電泳條帶，節(jié)省了染色脫色的時(shí)間。

產(chǎn)品貨號(hào)	產(chǎn)品名稱(chēng)
C8430	考馬斯亮藍(lán)R 250染色液
P1300	考馬斯亮藍(lán)蛋白膠快速染色液
P1305	考馬斯亮藍(lán)染色套裝
G7210	PAGE凝膠銀染試劑盒

PG00810-S	Precast-Gel預(yù)制膠	變性預(yù)制膠	10孔	8%	10片/盒
PG01010-S	Precast-Gel預(yù)制膠	變性預(yù)制膠	10孔	10%	10片/盒
PG01210-S	Precast-Gel預(yù)制膠	變性預(yù)制膠	10孔	12%	10片/盒
PG01510-S	Precast-Gel預(yù)制膠	變性預(yù)制膠	10孔	15%	10片/盒
PG41510-S	Precast-Gel預(yù)制膠	變性預(yù)制膠	10孔	4～15%	10片/盒
PG42010-S	Precast-Gel預(yù)制膠	變性預(yù)制膠	10孔	4～20%	10片/盒
PG82010-S	Precast-Gel預(yù)制膠	變性預(yù)制膠	10孔	8～20%	10片/盒
PG00810-N	Precast-Gel預(yù)制膠	非變性預(yù)制膠	10孔	8%	10片/盒
PG01010-N	Precast-Gel預(yù)制膠	非變性預(yù)制膠	10孔	10%	10片/盒
PG01210-N	Precast-Gel預(yù)制膠	非變性預(yù)制膠	10孔	12%	10片/盒
PG01510-N	Precast-Gel預(yù)制膠	非變性預(yù)制膠	10孔	15%	10片/盒
PG41510-N	Precast-Gel預(yù)制膠	非變性預(yù)制膠	10孔	4-15%	10片/盒
PG42010-N	Precast-Gel預(yù)制膠	非變性預(yù)制膠	10孔	4～20%	10片/盒
PG82010-N	Precast-Gel預(yù)制膠	非變性預(yù)制膠	10孔	8～20%	10片/盒

三、Western blot

經(jīng)過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類(lèi)型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分，此技術(shù)稱(chēng)為免疫印跡（Western blot）。Western blotting檢測(cè)系統(tǒng)除需要過(guò)氧化物酶標(biāo)記的各種二抗外，還需要配套的顯色試劑。索萊寶提供DAB顯色和ECL化學(xué)發(fā)光兩種試劑及相應(yīng)試劑盒。

轉(zhuǎn)膜
顯色

和PALL公司的尼龍膜和pvdf膜，具有0.22um和0.45um兩種規(guī)格。轉(zhuǎn)膜后還可以用P0012（10×麗春紅）檢測(cè)轉(zhuǎn)膜效果，尤其是針對(duì)NC膜效果更佳。為了節(jié)省成本和時(shí)間，您可以選擇本公司的SW3020（Western Blot膜再生液）對(duì)用過(guò)的膜進(jìn)行清洗，隨后，可以使用不同的抗體進(jìn)行下一輪Western Blot實(shí)驗(yàn)。膜再生液實(shí)質(zhì)是在不影響膜上結(jié)合的抗原的條件下將抗體洗脫下來(lái)，實(shí)際操作中，膜類(lèi)型、抗體類(lèi)型、濃度及抗原特性都影響洗脫難易度。注意：適用于 ECL和類(lèi)似的化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行的 Western 檢測(cè)。不適用于非化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行的 Western檢測(cè)，例如DAB，NBT/BCIP。

產(chǎn)品貨號(hào)	產(chǎn)品名稱(chēng)
P0012	10×麗春紅
SW3010	膜封閉液
A1800	抗體稀釋液
A1810	一抗稀釋液
A1820	HRP標(biāo)記抗體稀釋液
A1830	AP標(biāo)記抗體稀釋液
A1840	熒光抗體稀釋液
T1085	1×TBST

實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中您可以針對(duì)不同的抗體選擇上面合適的稀釋液。

蛋白電泳 SDS-PAGE及Western blot

蛋白電泳 SDS-PAGE原理

一、樣品制備

二、蛋白電泳

三、Western blot

二、蛋白電泳

三、Western blot